常用基因诊断技术

第二节　常用基因诊断技术

　　当细胞的基因组DNA用特定的内切酶如Eco RⅠ切割时，凡有GAATTC的地方都被切开，得到许多长度一定但互不相等的片段，需要分析、分离的基因或DNA片段就在其中某一特定的的片段上。

　　然而许多长短不同的DNA片段混合在一起是很难分析的。因此首先必需将它们按大小（长短）分离开来，微生物的基因，但也可用于检查人类基因组中的DNA序列。

　　二、聚合酶链反应

　　近年来，基因分析和基因工程技术有了革命性的突破，这主要归功于聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）的发展和应用。应用PCR技术可以使特定的基因或DNA片段在短短的2－3小时内体外扩增数十万至百万倍。扩增的片段可以直接通过电泳观察，也可用于进一步的分析。这样，少量的单拷贝基因不需通过同位素提高其敏感性来观察，而通过扩增至百万倍后直接观察到，而且原先需要一、二周才能作出的诊断可以缩短至数小时。PCR反应的原理如图13－7。

图13－7 PCR原理示意图黑色线代表引物

　　由图可见，首先应按照欲检测的DNA的5’和3’端的碱基顺序各合成一段长约17－20余个碱基的寡核苷酸作为引物（primer），其次是将待检测的DNA变性后，加入四种单核苷酸（dNTP）、引物和耐热聚合酶。在较低的温度，引物将与待扩增的DNA链复性结合，然后的聚合酶的作用下，利用溶液中的核苷酸原料，不断延伸合成新互补链，这样，一条DNA双链就变成了两条双链。若继续按照变性（92－95℃）→复性（40－60℃）→引物延伸（65－72℃）的顺序循环20至40个周期，就可以得到大量的DNA片段。理论上循环20周期可使DNA扩增2n，即100余万倍。PCR反应特异性强，灵敏度高，极微量的DNA即可作为扩增的模板得到大量的扩增片段。毛发、血痕，甚至单个细胞的DNA即可供PCR扩增之用。因此它用于病原体DNA的检查、肿瘤残留细胞的检出、罪犯或个体遗传物质的鉴定以及遗传病的基因诊断等。

　　已可对一系列的遗传病进行PCR诊断。如果疾病是由基因缺失引起的（如α地贫），则在缺失两端设计一对引物进行扩增，就不会得到扩增产物或只能得到缩短了的扩增产物。如果疾病是由点突变引起的，而突变的位置和性质已知，则在设计引物时使之包括突变部位，由于突变后的碱基不配对，结果无扩增片段；或者在引物设计时于其3’端设计一个错误的核苷酸，使之与突变了的核苷酸配对，其结果是正常引物不能扩增，而用错误的引物能扩增，从而可对突变的存在作出判断。

　　PCR技术目前有许多新的发展，用途日益扩大。例如，可用RNA为模板经过逆转录再行扩增的RT－PCR；改变两引物浓度，使其相差100倍，结果得到大量单链产物，称为不对称PCR，其单链产物可用于序列分析；在一个反应中加入多对引物同时检测多个部位的多重PCR等等。

　　三、扩增片段长度多态性

　　小卫星DNA和微卫星DNA的长度多态性可以通过PCR扩增后电泳来检出，并用于致病基因的连锁分析，这种诊断方法称为扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism,Amp-FLP）连锁分析法。PCR扩增后，产物即等位片段之间的差别有时只有几个核苷酸，故需用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离鉴定。此法多用于突变性质不明的连锁分析.

　　四、等位基因的特异寡核苷酸探针诊断法

　　当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成等基因特异的寡核苷酸探针（allele-specific oligonucleotide,ASO）用同位素或非同位素标记进行诊断。探针通常为长20bp左右的核苷酸。用于探测点突变时一般需要合成两种探针，与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能与突变基因序列杂交；另一种与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交，这样，就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区别开来.

　　PCR可结合ASO，即PCR－ASO技术，即先将含有突变点的基因有关片段进行体外扩增，然后再与ASO探针作点杂交，这样大大简化了方法，节约了时间，而且只要极少量的基因组DNA就可进行。

　　五、单链构象多态性诊断法

　　单链构象多态性（signle strand conformation polymorphism,SSCP）是指单链DNA由于碱基序列的不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同，从而可用于DNA中单个碱基的替代、微小的缺失或手稿的检测。用SSCP法检查基因突变时，通常在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物进行PCR扩增，然后将扩增物用甲酰胺等变性，并在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，突变所引起的DNA构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而可据之作出诊断。

　　PCR－SSCP法具有能快速、灵敏地检测有无点突变或多态性的优点，但如欲阐明突变的碱基性质，则需作序列分析。