肝纤维化(2)

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1.纤维连结蛋白质（Fibrnectin）

可分为血浆性（可溶性）和细胞性（不溶性），前者主要由肝细胞产生，后者主要由贮脂细胞、巨噬细胞及血管内皮细胞产生。在肝纤维化早期其含量增多，作为以后胶原沉积的支架。

2.层连蛋白（Laminin）

是由三个亚单位（一条α链和两链β链）组成的“十”字型结构，其分子内部有可与细胞表面受体和肝素结合的功能区。它和Ⅳ型胶原一起构成基底膜的主要成份，分布于血管、胆管基底膜上，肝血窦内皮下亦有少量分布，这对于维持细胞的分化状态有重要意义。

3.细胞粘合素（Tenascins,Cytotactin,Bronionectin,Hexabronchions）

是由6个相同的亚单位组成的六聚体，由贮脂细胞产生。肝纤维化是沉积于细胞损伤严重的区域，如中央静脉周围和细的纤维间隔中，可能在早期ECM的沉积中起作用。

4.粗纤维调节素（Undulin）

由3个亚基组成，其单体和层连蛋白相似，但少一个短臂，主要分别于紧密排列的Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维中，它对维持胶原的超分子结构起重要作用，其细胞来源尚不明了。

5.血栓粘合素（Thrombospondin）

由3个相同亚基的末端在中央形成一个小球体，能结合肝素、Ⅴ型胶原、纤维连结蛋白、血浆纤溶酶原和纤维蛋白原。其功能是防止细胞扩散。

6.副纤维连接蛋白（Vitronection,VN）

由肝细胞产生，其分布与纤维连接蛋白相似，具有结合胶原的功能。肝硬化时分布于胶原纤维沉积的部位。血浆VN水平和肝纤维化程度有一定的相关性。

7.副层连蛋白（Entactin,Nidogen）

呈不对称哑铃形，它可与层连接蛋白中心部位特异性以共价键结合，从而调节后者与其受体的结合。其分布和层连蛋白的单位相似，主要分布于基底膜。

（三）蛋白多糖（Proteoglycan）

蛋白多糖是一类由蛋白质作核心骨架，在N或O位上连有糖胺多糖（

Glycosaminoglycan,GAG）侧链的大分子物质，它们与胶原一起分布于细胞外基质和基底膜上，同时也分布于细胞膜上。其糖胺多糖可分为硫酸乙酰肝素（Heparan  Sulfate）、硫酸皮肤素（Dermatan Sulfate）、硫酸软骨素（Chondroitin Sulfate）及硫酸角质素（Keratan Sulfate）。正常肝脏中硫酸乙酰肝素含量最多，占肝脏总GAG的60%；肝纤维化时其含量下降，而硫酸皮肤素和硫酸软骨素的含量增加。透明质酸（Hyaluronic Acid）是一特殊的多糖，未经硫化亦不含蛋白骨架。近年已将许多蛋白多糖核心蛋白的cDNA克隆出来，对其生物学功能的了解也日趋深入。根据其分布不同大体可将蛋白多糖分为两类：

1.与细胞膜相关的蛋白多糖

其核心蛋白多有跨膜功能区，有的也可经其GAG侧链与细胞膜相连。它们含有大量的硫酸乙酰肝素和少量的硫酸软素，可与细胞外基质、生长因子、细胞粘附分子（CAM）及蛋白酶抑制物结合，使这些物质的活性增强或减弱。

Syndecan产生于肝组织和培养中的肝细胞（Hepatocyte），是一些细胞间质的受体，可通过其GAG侧链与Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原，纤维连结蛋白及细胞粘合素相结合。同时还是bFGF的辅助受体（Coreceptor）。其主要功能是信号传递。

Thrombomodulin由血管内皮细胞产生，其GAG侧链为硫酸软骨素。可与凝血酶结合，抑制纤维蛋白原和因子Ⅴ的激活，从而调节血液凝固过程。

Betaglycan其GAG侧链为硫酸软骨素和硫酸乙酰肝素。是细胞膜受体，对TGF-β有高亲和力，是它的Ⅲ型受体。

2.与细胞外基质相关的蛋白多糖

它们主要分布于细胞外基质中。

Fibromodulin其GAG侧链为硫酸角质素，可以调节胶原微纤维的形成。在肝脏中尚未发现。

Perlecan由非实质细胞产生，分布于基底膜和胆管、血管。可与内皮细胞和肝细胞结合。

Decorin其 GAG侧链为硫酸软骨素和硫酸皮肤素。可与Ⅰ、Ⅳ胶原、纤维连结蛋白结合，延缓胶原微纤维的形成。TGF-β可使Decorin的表达增加，而Decorin可使TGF-β灭活。在富含维甲酸的贮脂细胞中Decorin表达较高，因而可抑制TGF-β的活性；而在失去维甲酸的贮脂细胞中，Decorin的表达减少，因而对TGF-β的抑制减弱。

Biglycan其GAG侧链为硫酸软骨素和硫酸皮肤素，由贮脂细胞和肌成纤维细胞产生。通过其核心蛋白与TGF-β结合，通过其GAG与bGFG结合。TGF-β可使其表达增高，而维甲酸可使其表达减低。

Versican其侧链为硫酸软骨素，PDGF和TGF-β可使其表达增加。可与透明质酸结合。尚未确定肝脏细胞是否可产生Versican。

（四）细胞-间质粘附分子（Cell-Matrix Adhension  Molecules）

细胞和细胞外基质成份之间的分子相互作用是通过特定的质膜蛋白即各种粘附分子来实现的。一些在其他上皮细胞和内皮细胞上经常表达的粘附分子，在正常肝细胞和血窦内皮细胞中不表达，但在纤维化的发生过程中这些粘附分子的表达呈上调（Upregulation）改变。细胞一间质粘附分子主要包括Integrin家庭和CD₄₄蛋白家庭。

1.Integrin

是由α和β链非共价格结合组成的二聚体，现已知有17种α链和8种β链共组成21种有功能的二聚体。作为受体Integrin可以结合多种配体，而一种细胞外基质成分可由多种Integrin通过不同的识别位点结合。最重要的识别位点是细胞外基质分子中的R-G-D（精-甘-天）序列，大多数Integrin受体皆可识别之。各种Integrin有其特定的组织分布，一种细胞可以存在多种Integrin，其配体识别位点亦可有重叠。在非极性细胞上，Integrin分布于各个面，在极性细胞只分布于其底面和侧面。它们不仅起粘附作用，而且因其细胞内功能区与细胞骨架相连，故可以传递信号，促进细胞的增殖、分化和移行。根据β链可将Integrin分为3个亚族：

β₁（10种）、β₃（2种）、β₄（1种）其主要功能是介导细胞与间质的粘附，分布于大多数体细胞。可与胶原和非胶原糖蛋白结合，尚未发现它们与蛋白多糖结合。

β₂（3种）、β₇（2种）主要表达与白细胞介导免疫系统内细胞与细胞之间的相互作用。

β₆（1种）、β₇（1种）、β₈（1种）其分布范围局限，功能尚不清楚。

2.CD₄₄蛋白家族

是一类大量糖基化的跨膜蛋白，广泛分布于体细胞，可以介导细胞-细胞，细胞-间质的相互作用。本家族的成员亦很多，在正常状态下，肝细胞内检测不到CD₄₄蛋白的表达，但在血窦内皮细胞中可有表达。

粘附分子在肝纤维化过程中最显著的改变是肝细胞和血窦内皮细胞诱导表达Integrin家族中的层连蛋白受体，而且其表达上调改变早于肝硬化的形成。致纤维化的细胞因子如TGF-β和促进炎症的细胞因子如TGF-α、IL-1β、IFN-γ均可促进Integrin受体和CD₄₄蛋白的高表达。不管其基础疾病如何，Integrin受体的诱导表达情形相似，提示这是一种对细胞相邻细胞外基质成分改变的非特异性反应。Integrin受体的激活可以直接和间接地触发一系列的细胞内事件，如细胞的形态、生化、代谢、分泌、胞浆底物的酪氨酸磷酸化等，提示细胞外基质对于调节肝细胞和血窦内皮细胞的结构和功能起重要作用。在肝纤维化的早期，Integrin受体的表达可能促进细胞外基质在局部的沉积和组织，因而这种细胞-间质粘附分子的表达上调作用不仅是对细胞微环境改变的适应性反应，而且很可能在启动纤维化本身的过程中起主动的作用。

（五）基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinases,MMP）

细胞外基质主要被MMP所降解，到目前为止已发现了9种MMP，按其作用底物的不同可分为胶原酶、明胶酶、基质分解素3大组，其底物特异性和细胞来源见表。

表 基质金属蛋白酶的底物特异性和细胞来源

命名 肝脏中细胞来源 作用底物特异性 胶原酶 　 Ⅲ＞Ⅰ，Ⅱ，Ⅷ，Ⅹ 间质性胶原酶 贮脂细胞 Ⅰ＞Ⅲ 中性粒细胞胶原酶 — 　 明胶酶/Ⅳ性胶原酶 　 　 明胶酶A/Ⅳ性胶原酶（72KD） 贮脂细胞 Ⅳ，？Ⅴ，Ⅸ，明胶 明胶酶B/Ⅳ性胶原酶（92KD） Kuppfer细胞 Ⅳ，Ⅴ，明胶，？Ⅲ 基质分解素 　 　 基质分解素-1 贮脂细胞 Ⅱ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅸ，LN，蛋白多糖，LN，酪蛋白同上 基质分解素-2 — 同上 基质分解素-3 — 尚不清楚 基质分解素（Matrilysin） — Ⅳ，蛋白多糖，FN，明胶，弹性硬蛋白 其他 　 　 金属弹性酶（Metalloelastase） — 弹性硬蛋白，Fn

这些基质金属蛋白酶都属于一个基因家族，它们的结构中有数个氨基酸序列高度保守的共同功能区，例如它们都有对于维持酶原潜伏性的前肽功能区（含PRCGVPDV序列），120个氨基酸的N端功能区以及催化位点的锌结合功能区（含HELGH序列），基质金属蛋白酶的调节可发生在基因转录调控、无活性酶原的激活及组织抑制物对已被激活酶的抑制三个水平上。

一些生长因子、细胞因子和维甲酸共同调控多种基质金属蛋白酶的表达，有些则特异地对某种基质金属蛋白酶的表达有调控作用。

基质金属蛋白酶是以无活性的酶原形式分泌出来的，必须在细胞外间隙中经过水解激活才能降解细胞外基质。尿激酶纤溶酶原激活物（Urokinase-plasminogen  Activator,UPA）或组织纤溶酶原激活物（Tissue-plasminogen Activator,TPA）将纤溶酶原转化为纤溶酶，纤溶酶再激活基质分解素，部分激活胶原酶前体，而被激活的基质分解素又进一步激活胶原酶。这一激活的瀑布系统受到纤溶酶原激活物抑制因子-1（PAI-1）的调节。合成基质金属蛋白酶的细胞往往同时也合成纤溶酶原激活物抑制因子，以防止基质的过度降解。

（六）金属蛋白酶组织抑制因子（Tissue Inhibitor of Metalloproteinases,TIMP）

已经激活的基质金属蛋白酶在细胞外间隙又受到特异性金属蛋白酶组织抑制因子的调节。现已发现三种TIMP，每种TIMP都可与催化部位直接结合而抑制所有基质金属蛋白酶的活性，但TIMP-1主要抑制间质性胶原酶、基质分解素和明胶酶B（92KD Ⅳ型胶原酶），TIMP-2主要抑制明胶酶A（72KD Ⅳ型胶原酶）。最近又发现TIMP还能和某些金属蛋白酶原的羧基末端结合而防止其被激活。

（七）细胞因子（Cytokines）和生长因子（Growth Factors）

细胞外基质可作为贮存细胞因子和生长因子的场所，当其他细胞外基质成分发生改变时并通过各种细胞外基质粘附分子对细胞因子的活性起调节作用，细胞因子又可促进其他细胞外基质的合成或降解。

二. 细胞外基质的细胞来源

肝脏细胞（Liver Cells）可分为：①肝实质细胞即肝细胞（Hepatocyte）；②非实质细胞，包括贮脂细胞（Ito细胞）、血窦内皮细胞、Kupffer细胞和陷窝细胞（Pit Cell）。经过体外细胞培养、免疫组织化学及分子原位杂交研究，对细胞外基质的来源有了较多的了解。以前曾认为胶原主要由肝细胞合成，后来发现主要由贮脂细胞产生；而且其他细胞外基质亦主要由贮脂细胞产生。现将细胞外基质的细胞来源归纳于表。

表 细胞外基质的细胞来源

细胞类型 所产生的细胞外基质 肝细胞 Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ型胶原，纤维连接蛋白，VN，蛋白多糖 贮脂细胞 Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ型胶原，层连蛋白，细胞粘合素，副层连蛋白，蛋白多糖 血窦内皮细胞 Ⅳ型胶原，纤维连接蛋白，血栓粘合素 Kupffer 明胶酶，TIMP

【辅助检查】

一、临床及影像学诊断

任何慢性肝病尤其是慢性病毒性肝炎患者都有发生肝纤维化和肝硬化的可能性，因此对每一个此类患者都要仔细询问病史和进行全面的体格检查，以及早发现早期肝硬化的诊断线索。现代影像学手段如B型超声、CT、磁共振成像（MRI）等可以发现肝包膜增厚、肝表面轮廓不规则或呈结节状、肝实质的回声不均匀增强或CT值增高、各叶比例改变、脾脏厚度增加及门静脉和脾静脉直径增宽等。采色多普勒超声检查或放射性核素扫描可以测定肝脏动脉和门脉的血流量及功能性门体分流情况。

二、组织病理学检查

到目前为止，经肝穿刺或经腹腔镜肝活检，进行组织病理学检查仍是诊断肝纤维化和肝硬化的“金标准”，1994年国际慢性肝炎新的分级、分期标准建议将肝脏纤维增生作为病情分期的依据，与分级（主要是炎症、坏死的程度）分别评分。国内也提出了相应的分级、分期建议。常规HE染色和各种细胞外基质的组织化学、免疫组织化学甚至分子孙原位杂交技术使我们从肝组织标本中得到期更多的有关肝脏纤维化方面的信息；计算机图像分析等各种技术更能提供定量的资料以便于观察抗纤维化治疗的效果。但是肝活检技术也有其局限性，因为慢性肝炎等病变虽然是弥漫性的，但很难保证一次取材能反映整个肝脏的全貌，尤其是肝纤维化和肝硬化时细针负压肝穿刺难以获得足够的标本给诊断带来一定的困难。为了药物评价，应做到动态系列进行肝活检组织病理学检查。

三、肝纤维化的血清学诊断

鉴于肝脏穿刺组织病理检查的局限性，人们一直致力于寻找血清学指标来监测肝纤维化的发展过程和判断抗纤维化的疗效。理想的肝纤维化血清学指标应具备一些条件：①肝脏特异性高；②能没定肝脏纤维增生或降解的过程，反映肝脏纤维化的程度及肝脏实质和间质结构的紊乱；③不被血窦内皮摄取，不经胆道和肾脏排泄；④测定方法简便易行，敏感性高。实际上现有的测定血清中细胞外基质成分的试验都不完全符合这些条件，但是经过动物实验和临床病理研究发现了不少对判断肝纤维增生有一定价值的指标。总的来说，在动物实验中这些指标和肝脏中相应的细胞外基质成分及其mRNA水平有较好的相关性；在临床研究中这些指标和肝组织病理学纤维化程度也有一定的关联，慢性活动性肝病（所谓慢性活动性肝炎和活动性肝硬化）时高于非活动性肝病（慢性迁延性肝炎和非活动性肝硬化）。但是各组之间有较多的重叠，难以凭一次结果作出肯定的诊断；联合应用多项指标和动态测定可能更有助于判断纤维增生和纤维降解的相对强度。下面仅介绍研究较多的几种肝纤维化血清学指标。

1.血清Ⅰ型胶原（CI）及Ⅰ型前胶原羧基端肽（PICR）

肝脏中Ⅰ型胶原含量较多，在肝纤维化和肝硬化晚期升高明显，血清中含量和肝纤维化程度有较高的相关性，有人建立RIA方法并测定了正常人血清CI的含量的上限为197μg/L(M±2SD)，在急性肝炎不升高，在各种慢性活动性肝病中升高，且与肝脏纤维化积分的相关系数为0.67(P＜0.0001)，而与肝脏炎症指数无相关性。在慢性肝炎和酒精性肝病中若血清CI高于300μg/L，则诊断肝硬化的特异性很高。在酒精性肝病患者血清CI升高且停止饮酒后其血清PICP水平降低，而此时血清CI水平无明显变化，提示PICP能反映肝脏纤维增生情况，而CI反映的是肝脏原纤维的沉积。但是，CI和CPCP受骨代谢的影响较大，因而肝脏特异性较差，故限制了其临床应用。

2.血清Ⅲ型胶原（CⅢ）及Ⅲ型前胶原氨基端肽（PⅢNP）

国外有人用RIA其所长测定了正常人的血清CⅢ的上40μg/L(M±2SD)，在慢性活动性肝病时升高，其升高可能是新分泌的过量的Ⅲ型胶布原从血窦内皮细胞的间隙漏到血循环。血清中CⅢ水平和肝组织纤维化有相关性(r=0.35,P＜0.01)，且和炎症活动也有一定的相关性。国内报道血清CⅢ（PCⅢ）水平和肝组织纤维化程度密切相关(r=0.984,P＜0.01)，并有人证明在慢性肝炎和肝硬化患者中血清PCⅢ和PⅢP有相关性(r=0.510)。

这是研究得最多的肝纤维化血清学指标。它是Ⅲ型前胶原分泌到细胞外后被肽酶切下的N端肽，端肽（N，C）切下后才形成胶原分子，相互交联成微纤维。故PⅢNP升高反映的是肝脏纤维增生情况。动物实验表明血清PⅢNP水平升高和肝脏组织中胶原mRNA及TGF-βmRNA水平的升高密切相关；临床研究也发现血清PⅢNP水平和肝脏组织纤维化程度有良好的相关性，是反映肝脏纤维增生的指标。也有人认为它和肝脏炎症活动指数关系更密切，因而在急性肝炎时亦升高；另外它的排泄需要肝血窦内皮细胞的摄取，故在肝功能衰竭时血清中PⅢNP亦升高。临床上应根据具体情况解释测定结果。我们应用德国公司生产的PⅢP RIA药盒（现由日本公司生产）测定了67例各种慢性肝闰伴Ⅰ至Ⅳ级肝纤维化患者的血清PⅢNP水平分别为12.3±3.3ng/ml、17.9±5.5ng/ml、21.5±11.8ng/ml及32.9±12.7ng/ml，表明PⅢP与肝纤维化程度呈正相关。值得注意的是不论是原发性肝癌或是转移性肝癌患者的血清PⅢP水平均明显高于其他慢性肝病患者，故对于慢性肝炎患者如血清PⅢP持续异常升高，应警惕肝癌的可能性。

3.血清Ⅳ型胶原（CⅣ）及Ⅳ胶原羧基端肽（CⅣCP，NCI）和Ⅳ胶原氨基端肽（CⅣ NP，7S）