尖锐湿疣(2)

MY09：CGTCCMARRGGAWACTGATC

表1

HPV型

MY11的第1个硷基位置

MY09的第1个硷基位置

PCR产物长度（bp）

6

6722

7170

448

11

6707

7155

448

16

6584

7035

451

18

6558

7012

454

33

6539

6987

448

 M=A+C， R=A+G，W=A+T，Y= C+T

表2列述了Manos等设计的寡核苷酸探针。公用混合探针序列选自HPVL1区中另一保守序列，可与       MY11和MY09引物产生的多种HPVL1 PCR扩增产物杂交：型特异探针只与相应HPV型有互补序列，用于检出的HPV分型。

表2   Manos等设计的HPVL1 PCR产物探针

公用混合探针

GP1   CTGTTGTTGATACTACACGCAGTAC

GP2  CTGTGGTAGATACCACWCGCAGTAC

第一个硷基位置

HPV6   6771                  HPV11  6757                          HPV16   6631

HPV18  6607                  HPV33  6588

型特异探针

探针

HPV型

序列

基因位置

MY12

HPV6

CATCCGTAACTACATCTTCCA

6813—6833

MY13

HPV11

TCTGTGTCTAAATCTGCTACA

6800—6820

MY14

HPV16

CATACACCTCCAGCACCTAA

6926—6945

MY74

HPV18

GGATGCTGCACCGGTCTGA

6905—6922

MY16

HPV33

CACACAAGTAACTAGCTACAG

6628—6648

H=A+C+T，R=A+G，W=A+T，Y=C+T

2．PCR反应试剂：Taq DNA聚合酶（2U/ml）、10mmol/L dNTP贮备液（dATP、dCTP、dGTP、dTTP各10mmol/L），10×PCR缓冲液(500mmol KCl、40mmol/L MgCl2、100mmol/L Tris-HCl、pH 8.5)，100μmol/L MY11和MY09贮备液，灭菌的玻璃蒸馏器制备的蒸馏水。

3．PCR扩增方法和程序：以100μl PCR反应液,用无菌0.5ml硅化塑料离心管为反应管进行扩增反应。

（1）实验前配制预混反应试剂并分装。预混反应试剂包括除标本DNA外的其它各种PCR反应试剂。每支反应管中含有的PCR反应试剂见表3。

表3    每支反应管中的PCR反应试剂

反应试剂

体积（μl）

终浓度

10×PCR缓冲液

10

1×PCR缓冲液

dNTP贮备液

2

200μmol/L每种dNTP

MY11贮备液

0.5

500μmol/L

MY09贮备液

0.5

500μmol/L

Taq DNA聚合酶

0.5

2.5μ

灭菌蒸馏水

75.5

  

总计

90.0

  

（2）各反应管依次加入10μl标本和90μl预混反应试剂。

（3）加入80-100μl石蜡油，在台式离心机上快速离心数秒钟，使各反应试剂收集于油层下。目前，PCR试剂已商品化，反应体积为25μl。使用时只加入标本DNA即可。

（4）将反应管置PCR扩增仪上，循环参数为95℃ 30s，55℃ 40s，72℃ 50s循环35次，最后72℃延伸5min。

4．每次试验应设阳性及阴性对照。以载有HPV的重组质粒（每反应为100pg）或含有HPV的细胞系（如Caski、HeLa）DNA为阳性对照，以无HPV的人细胞系DNA为阴性对照。

（三）扩增产物的检测和分析

1．  凝胶电泳：扩增反应结束后，取出反应管，冷却至室温，取10μl扩增产物用5%-7%聚丙烯酰胺凝胶或1.5%琼脂糖电泳，溴化乙锭染色，紫外分析仪下分析结果，分子量约为450bp处出现明显的DNA带。

2．  核酸杂交：如果凝胶电泳无清楚的DNA或需确定DNA带的特异性时，可用标记的公用混合探针和（或）型特异探针作Southern吸印杂交、斑点杂交验证。

按照标准方法制32P ATP标记的寡核苷酸探针，需达到约107cpm/pmol特异活性。杂交液中需含有2×106-5×106cpm探针/ml。在55℃缓慢振荡下杂交2-3h，随后于30-55℃下用洗涤液（2×SSC、0.1%SDS）迅速冲洗杂交膜，除去多余探针。然后进行洗膜，其条件依所用探针而异：公用混合探针，55℃洗膜10min；MY12、MY13及MY16探针，56-57℃下10 min，并换液重洗1次；MY14及WD74探针，58-59℃下10min，亦换液重洗1次。

用PCR方法检测HPV比核酸杂交方法优越。其敏感性高，GP-PCR方法以凝胶电泳直接分析结果，可检出标本中200个拷贝的HPV DNA，若以核酸杂交检测PCR产物，敏感性提高，能检出10个拷贝的HPV DNA。

鉴于PCR技术的高度敏感性，以生殖道脱落细胞为检材足以满足试验要求，避免了活检取材、研磨组织繁杂操作。一般情况下，PCR扩增产物经凝胶电泳，观察产生的DNA可直接作出诊断。因此，PCR技术检测HPV实验周期短、简便快速。

【鉴别诊断】

1．生殖器鳞癌；多见于40岁以上或老年人，皮损向下浸润，发生溃疡，组织病理有特征性改变。

2．扁平湿疣：为多个湿丘疹融合成片状的皮损，多见于肛周，皮损处可查到梅毒螺旋体，梅毒血清试验呈阳性反应。

3．珍珠状yinjing丘疹病：为沿冠状沟排列，针头及粟粒大小的皮色或淡粉红色丘疹。组织病理无凹空细胞。

4．假性湿疣；损害为局限于小yinchun的粟粒大呈鱼卵状淡红色小丘疹或绒毛状改变，皮损表面光滑，醋酸白试验阴性，病理上无具有诊断意义的凹空细胞。

5．鲍温样丘疹病；为棕红色或色素性小丘疹，组织病理可见异型鳞状细胞及类似原位癌的组织象。

【预防】

控制性病是预防CA的最好方法。发现治疗患者及其性伴；进行卫生宣教和性行为的控制；yinjing套具有预防HPV感染的作用，目前尚无有效疫苗。