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生殖器疱疹(2)
来源：求医网 作者：求医网 点击:次 时间：2008-02-22
①第一步电泳鉴定: 取10μlPCR产物加4μl样品缓冲液,加入2%琼脂糖凝胶板,70V电泳(5-20min)加EB染色5min后,紫外灯下观察,可初步鉴定扩增产物大小。
②酶切分析：分别取20μlPCR产物于2个Eppendorf管中，加入50μl无水乙醇，-20℃沉淀DNA，再分别用20μlSmal和BamHI反应缓冲液溶解，加入SmaI或BamHI 50U于相应Eppendorf 管内，37℃作用1h。
③第二步电泳分型，取10μlPCR酶切物加4μl样品缓冲液，加到2%琼脂糖凝胶中,70V电泳,15-20min后, EB染色5min,与同步加入未酶切的PCR产物相对照。 紫外灯下观察, 结果如下:
PCR-EC法检测四种病毒结果
病毒型号
靶片段
SmaI
BamHI
HSV1
518bp
476bp+42bp
HSV2
518bp
—
225+293bp
EBV
524bp
100bp+424bp
277bp+247bp
CMV
589bp
不需酶切,第一步电泳就可以区分
（四）用RT-PCR检测单纯疱疹病毒
RNA的聚合酶链反应（RNA-PCR），可能通过检测HSV不同期的RNA，这不仅可诊断HSV感染，而且有利于HSV的潜伏期感染机制的深入研究。
RT-PCR是以RNA为模板经逆转录反应（RT）产生cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增以达到检测目的。因此，RNA-PCR也可称为RT-PCR。
1、标本处理：
组织块细胞总RNA提取，取100mg组织标本，加1ml硫氰酸胍变性液，于匀浆器中，室温研磨均匀后，移入2.5mlEppendorf 管中。依次加入0.1ml3mol/L(pH4.0)NaAc, 1ml水饱和酚和0.2ml氯仿一异戊醇混匀, 用力振摇10s, 置冰浴15min。10000g4℃,离心20min,取上清水相(上层DNA、下层DNA和变性蛋白质)加入等体积异丙醇置-20℃1h, 沉淀RNA。离心 15000r/min×10min,弃上清, RNA重新用0.3ml硫氰酸胍变性液溶解, 再加0.3ml异丙醇沉淀, -20℃1h, 沉淀RNA. 离心15000r/min×10min, 去上清, 沉淀RNA用75%冷乙醇洗一次, 真空干燥。.加10μl TE缓冲液（pH7.4）溶解,低温保存备用.临用前冰浴溶解。
2、PCR扩增:
（1）引物设计: 选择HSV-1ICPO基因(极早期)为检测靶基因.设计2个引物，
P1 5′GGATCCTCACGTGGTTACCCGCGGTCT 3′
P2 5′AAGCTTCCGGGGCCGTCCCCGCGGGCG 3′可以扩增ICPO 中266bp序列。
1个探针：5′CCGGCTGGAGCCGCCGCACCCTGCT3′。
（2）PCR实验体系： 总反应体积为50μl，模板10μl （0.25-1.0μg）P1 1μl (20pmol/L)；P2 1μl (20pmol/L); 4×dNTP 4μl（200μmol/L)； 10×缓冲液5μl； AMV(逆转录酶) 2μl (50U)； DW 26μl； 循环参数, 94℃变性2min后 94℃50s，60℃60, 72℃60s，循环40次后72℃延伸5min。
3、扩增产物的鉴定：
（1）琼脂糖凝胶电泳染色法：取10μl PCR扩增产物加4μl 样品缓冲液，混匀后加样2%琼脂糖凝胶板，70V电泳15-20min，EB染色5min。紫外灯下观察扩增条带。
（2）Southern印迹杂交法：用32P标记的特异性探针检测PCR产物，方法同上。
总之，在HSV感染性疾病的临床诊断中，PCR能对前病毒或潜伏期低复制的HSV特异性靶DNA片段进行扩增检测，远较DNA探针敏感，并能在血清中抗体出现前就可以检出。因此，PCR无论是作为基础研究手段，还是作为临床检验诊断方法，均具有广阔的前景。
五、病理组织学诊断
细胞内水肿，基底层形成大水疱，病灶周围有多核巨细胞浸润，特别是多核白细胞与淋巴细胞充斥于病灶中间。
本病有自限性，约1-2周即可自愈。治疗的目的是防止下次复发。本病目前尚无特效药物，治疗原则为缩短病程，防止继发感染，减少复发。
1．局部疗法：原则为干燥、收敛、保护患部，防止继发感染。可外涂2%龙胆紫溶液，或选用10%次没食子酸铋（代马妥dermatol）、氧化锌油膏或泥膏、紫草生地榆油膏、0.5%新霉素软膏、或0.25%~0.1%疱疹净（IDU）软膏、5%疱疹净二甲基亚砜溶液（用于皮肤疱疹）等。对颜面部者亦可用10%醋酸铝或锌铜合剂。
2．全身治疗：治疗原则其一使感染的HSV不能活化，甚至消灭病毒；其二调节免疫，防止再发，可用阿昔洛韦静滴或口服，丽珠威口服，干扰素肌注，白细胞介素Ⅱ肌注。我们在治疗复发性生殖器疱疹时，使用四医大生物技术中心产的干扰素300万单位肌注，每日一次，10次为一疗程，共三个疗程，适当配合使用白细胞介素Ⅱ或利百多或灵杆菌素，95%的病人不复发。
下面介绍别人治疗疱疹方法供参考：
一、抗HSV药物
（一）无环乌苷是公认的有效药物：
1．原发和初发感染：ACV200mg，每日5次，连服7天；或ACV 5mg/kg，按体重静注，8小时一次，连续5-7天。
2．复发感染时，ACV 200mg，每日5次，连服5天，或ACV800mg，每日2次，连服5天；若在刚开始出现前驱症状时或在损害出现后的2天内即开始治疗，则对部分患者可能有效
3．复发频繁时：ACV200mg，每日3次，可连续服用6-12个月。在经常复发的患者中（每年>6次），每日治疗至少可以减少75%的复发次数，在接受长达3年治疗的人群，已确定是安全有效的。从接受治疗的人群中已分离到耐ACV的HSV株，但免疫功能正常者未见治疗失败者。治疗1年后应停药，以便重新评价患者的复发率。
4．免疫受抑制患者：首发或复发的急性患者：静注ACV（5mg/kg/8h）或口服ACV400mg×4次/日，共7-10天；抑制复发：每天静注ACV（5mg/kg/8h）或口服ACV（400mg×3-5次/天），可预防复发。
5．HSV直肠炎，ACV 400mg，每日5次，可缩短病程。免疫受抑制或重症者可静注ACV5mg/kg/8h。
6．新生儿HSV：现有资料认为，不应该常规应用ACV治疗通过产道感染的无症状婴儿，治疗仅限于有HSV临床表现及产后病毒培养阳性的患儿。所有新生儿HSV感染者应接受ACV或阿糖腺苷治疗。常采用ACV300mg/kg/d，阿糖腺苷30mg/kg/d，静脉注射共10-14天。
7．合并HIV感染：患者需口服ACV间歇或每日抑制治疗。对合并HIV感染者增加ACV剂量是十分有益的。
ACV400mg，口服，每日3-5次，治疗有效，应持续用药直至临床症状消失；对重症者，应用ACV静脉给药，对可疑或已证实的ACV耐药株引起的重症患者，最佳方案可能是：ACV400mg/kg，静脉注射，每8小时一次，直至临床痊愈。
HIV感染者中的皮肤损伤粘膜HSV感染时大剂量ACV治疗无反应者日益增多。大剂量ACV对部分患者有助于损伤的愈合，但不能阻止另外一些患者的病情进展。对复发频繁者长期服用ACV不能制止继续排毒，因此，仍可对性伴感染，此时若改用作用机理不同的抗病毒药物如磷甲酸和阿糖腺苷等可能有效。
ACV的抗病毒机理是它很容易被HSV编码的胸苷激酶磷酸化，形成ACV-MP，再被细胞激酶作用而形成ACV-TP。ACV-TP与dGTP竞争而抑制病毒DNA合成。
ACV全身应用治疗首次临床发作或作为抑制治疗药物时，可使疱疹发作的症状和体征得到控制。然而，该药既不能根除潜伏病毒感染，也不能影响以后发作的次数和严重性。该药局部治疗的效果比口服差，故不提倡局部用药。
ACV可缩短生殖器疱疹病程，加速愈合及缓解症状，长期应用可减少复发，曾有人对11000例免疫正常的GH连续治疗5年，在此期间复发率明显降低。
但是长期口服ACV不能清除骶神经节的潜伏病毒，停药后生殖器疱疹仍可复发，对ACV有耐药性的病毒株越来越多，几乎所有耐药性都发生于曾经进行多个病程治疗的免疫受损害者。
ACV静脉应用的主要副作用是由于药物在肾实质内结晶而引起的暂时性肾功能不全。若缓慢给药一小时以上或大量饮水则可避免此副作用。
（二）、病毒唑（三氮唑核苷，Ribavin RBV）：抑制病毒多种DNA及RNA复制，合成。
用量：原发GH及AIDS合并HSV感染，15mg/kg/d，肌注；复发GH，0.4g,口服,每日4次,3天后改为0.4g,每日2次,共5天,疗效肯定,用于耐药病毒株。
（三）、磷甲酸（Trisodium Phosphonoformate，PFA）；选择性抑制疱疹病毒诱导的DNA依赖的DNA聚合酶，主要用于耐ACV病毒株的感染。
用量：40-60mg/kg/d，静脉注射，每8小时1次，连用4次，可用于AIDS合并HSV感染。外用0.3%-1%PFA霜。副使用有肾毒性及钙磷代谢紊乱。
（四）、双羟丙氧甲基乌苷（更昔洛韦，Ganciclovir，DNPG）：是ACV的衍生物，通过抑制病毒DNA复制，导致RNA合成受阻，感染细胞DNA多聚酶是作用的靶部位。
用量：5-10mg/kg/d，分3次静注，连续14天，副作用有造血系统抑制及肝损害。
（五）、氟阿糖碘胞苷（FIAC）：对HSV-1和HSV-2有同样作用，选择性作用于被病毒感染的细胞，其代谢产物5-碘尿嘧啶、5-甲尿嘧啶均有抗病毒作用。阿糖腺苷磷酸抑制病毒DNA合成，有广谱抗病毒活性，副使用少，不能防止潜伏感染的建立，但防止病毒进入中枢神经系统有一定保护作用。抗HSV单克隆抗体局部外用，对GH有治疗作用，国外有人报道治疗HSV-2总有效率92.6%，基本治愈率44.1%。
（六）、消炎痛（Indomethacin）：作用为抑制前列腺素合成，有助于减少GH的复发，促进conA及PHA（植物血凝素）刺激所发生的细胞增殖作用，加强NK细胞的杀伤能力，可用于复发GH的治疗，用量：25mg口服，每日3次。
（七）、聚肌胞（Poly ZIC）：是人工合成的干扰素诱导剂，能刺激吞噬作用，增强抗体形成，对免疫系统起调节使用。用量2mg，肌注，2-3次/周。
二、对妊娠GH的处理
对孕妇使用无环鸟苷的安全性尚未肯定，但研究发现，用ACV的孕妇畸胎发生率与正常人相比，并无增高，但ACV对妊娠及胎儿的危险性尚未得出可靠结论。
对威胁母亲生命的HSV感染，如脑炎，肺炎及肝炎，应采用ACV静脉用药，但无威胁生命的HSV感染，不必全身用ACV治疗。
依照美国传染病学会建议，对妊娠期反复发作的GH处理方案如下：
（一）分娩时如无活动性生殖器损害，则无需剖腹产；
（二）妊娠未3个月，症状性复发是短暂的，只要分娩时无活动性损害，可经yindao分娩。
（三）临产时有活动GH者，可作如下处理：①羊膜未破，孕妇不发热，胎儿尚未成熟，应延缓分娩；②如系足月妊娠，羊水已破，胎儿肺已成熟，应行剖腹产。
单纯疱疹病毒属于病毒科，直径180nm，是较大的DNA病毒。它可以分为HSV-1和HSV-2两个亚型，它们在生物学、自然属性以及人类对它们的免疫方面存在着不同。但这两个亚型感染引起的病理生理却相同。HSV的核酸结构为双股线状DNA，每股DNA分长、短两个部分。分子量约为100×106道尔顿，15万硷基对，可编码60个以上的基因产物。在DNA病毒中，单纯疱疹病毒基因结构具有特殊性，因为它的两个独立的核苷酸序列两侧有倒置的重复序列，这两个核苷酸序列能够互相倒置联系，病毒DNA有四种异构体。HSV-1和HSV-2的病毒基因有50%左右的同源性。
HSV病毒形态呈球形，病毒核衣壳表面是由162个壳微粒组成的对称20面体（100-110nm），其内是由DNA组成的核心，蛋白质外壳包绕着病毒基因组，外面有一层脂膜。在衣壳和包膜之间是一种多蛋白组成的被膜。HSV有三类基因，分别为α、β和γ基因。HSV感染神经细胞但不造成细胞死亡，病毒在感染细胞内处于抑制状态，被感染细胞的存活与功能也不受影响，把这一过程称为潜伏。病毒基因激活后病毒开始复制，有时可形成疱疹性损害，这一过程称为复发。潜伏感染神经元细胞核内有大量的两种RNA转录体，它们与称作ICP-O的直接早期（α）基因产物重叠，这些RNA转录体按“反义”方向编码，表示它们可能是β和γ蛋白转录的抑制因子，当病毒处于潜伏状态时，其复活能力也被降低，对病毒潜伏的分子机理的了解可能有助于为预防HSV复发找到新途径。 HSV主要经过皮肤、粘膜或破损处进入人体内，首先在表皮或真皮细胞内复制。不论有无临床症状，病毒在局部充分复制后感染感觉神经或自主神经未稍。病毒沿神经轴索进入神经节内的神经细胞中。动物实验发现，从皮肤粘膜接种HSV到神经节内的神经细胞发现病毒，大约2天时间，可见其感染速度相当快。 HSV-1通常由呼吸道、消化道及皮肤粘膜密切接触感染。所以HSV-1常潜伏在三叉神经根和颈上神经节内。故临床所见主要是颜面部位的疱疹，HSV-2主要因性行为传播，生殖器接触而感染，所以HSV-2则常潜伏在骶神经节内，故临床主要表现为生殖器疱疹。患者血清学均为阳性，可终生有泌尿生殖道HSV间歇性活动。 感染最初阶段，病毒先在神经节及与之相接触的神经组织内复制，然后通过感觉神经到达其未稍而使与之相关的皮肤、粘膜表面发生皮损。病毒从外周感觉神经扩散到皮肤、粘膜，这一情况，可以解释表皮大面积受感染和远离原发部位新病损发生的原因。原发性HSV感染病人常有这些特点，而且从远离接种部位的神经组织中发现病毒。初次发病临床症状消退后，在神经内不再分离到感染性病毒。在细胞表面也检不出病毒蛋白。各种刺激因素，如免疫抑制、劳累、感染、精神创伤以及皮肤神经节创伤等都可引起病毒复活。 原发感染缓解后，神经节中找不到感染的病毒和病毒结构蛋白，潜伏感染神经细胞中的病毒基因