基因诊断的原理(3)

GG C 同上 KpnⅠ GGTAC↓C Klebsiella pneumoniae MboⅠ ↓GATC Moraxella bovis PstⅠ CTGCA↓G Providencia stuartii

　　*被甲基化

　　条链在同一水平切开，得到平齐末端（blunt terminus）(图13－2)。由于具有相同粘性

图13－2 限制酶的两类切割方式

　　末端的DNA片段在DNA连接酶的作用下很容易共价连接，因此被广泛地应用于重组DNA操作中。具有相同平齐末端的DNA片段也可以连接，但连接效率只有粘性末端连接效率的1％。

　　限制酶的上述特性在基因工程和基因诊断中具有重要用途：①首先不论DNA的来源如何，用同内切酶切割后产生的粘性末端很容易重新连接，因此很容易将人和细菌或人和质粒任何两DNA片段连接在一起，即重新组合，是重组DNA技术的基础。②人类的基因组很大，不切割无法分析其中的基因。限制酶能把基因组在特异的部位切开，即切割不是随机的，因而从每个细胞的基因组得到的是相同的一组长度各异的片段。这些可能含有某一基因的片段可用电泳分离，并加以研究。③由于限制酶的特异性，如果识别位点的碱基发生了改变，限制酶将不再能切割；同样，碱基的改变也可能导致出现新的酸切位点。在人类基因组中，这两种情况是十分常见的，而切点的消失或出现将影响获得的DNA片段的长度，表现为限制性片段长度多态性（RFLP），这在基因的连锁诊断中具有极重要的意义。

　　三、限制性片段长度多态性

　　一个人的两套单倍体DNA是不完全相同的，一般每100－500个碱基对就有一个是不相同的。换言之，如果把两套基因组DNA（各3.2×109bp）排列起来，那么平均有1000万处不同，它们多位于内含子序列中。实际上，除单卵双生子外，人群中没有两个个体的基因组DNA是完全相同的。

　　DNA的多态性虽可通过DNA测序检出，但用限制酶消化却是最常用的检测方法。

　　1．RFLP由于碱基的变异可能导致酶切点的消失或新的切点出现，从而引起不同个体在用同一限制酶切时，DNA片段长度出现差异（图13－3），这种由于内切酶切点变化所导致的DNA片段长度的差异，称为限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymporphism, RFLP）。RFLP反映了常见的个体间DNA核苷酸的可遗传性变异，它按照孟德尔方式遗传。RFLP可用Southern印迹杂交法（见下节）检出。用Southern杂交检出RFLP时，如探针跨越切点，则被切开的两个片段均可与探针杂交，从而显示两条杂交带（图13－4）。

图13－3 RFLP示意图箭头酶切位点；

左图：等位基因2由于出现新的切点，DNA片段缩至8kb;

右图：DNA片段电泳后杂交图

13－4 RFLP的检出等位基因1因有额外切点而导致产生
两个长短不同的DNA片段（3kb及5kb）且均能与探针杂交

　　2．两点RFLP

　　（1）点多态（point polymorphism）：是由于单个或少数碱基的改变引起酶切点的出现或消失所致的RFLP。上述的RFLP即属于这一类。它们属经典的RFLP。在人类基因组中已发现数以百计的此类多态位点。

　　（2）数目变异的串连重复（variable number tandem repeats,VNTR）：上述经典的单个碱基取代所致的RFLP一般只能检测到一种杂合性的两种形式，即“有”或“无”某个限制酶切位点，而且每个位点在人群中的杂合子频率通常不会超过50％，当被测个体为纯合状态时，利用RFLP就无法得到所需要的多态信息。此外，在整个基因组中，这类RFLP发现的数量还有限，并分布不匀。

　　但是，在人类基因组中还存在一类DNA重复序列，称为小卫星DNA。它们分布十分广泛，每一个单位通常只有16-28bp长，但其重复次数在人群中是高度变异的。当用限制酶切割VNTR区时，只要酶切点不在重复区内，就可能得到各种长度不同的片段（图13－5）

　　与小卫星DNA不同，另一类重复序列是卫星DNA。它们的基本序列有1－6bp，如（TA）n、(CGG)n等，通常重复10－60次并呈高度的多态性。

图13－5 VNTR导致的RFLP重复次数的变异致酶切位点的移动和DNA片段长度的变异

　　VNTR具有高度的变异性，同时也是按照孟德尔方式遗传的，因此是很好的遗传标记，由于它们类型众多和在基因组中分布广泛，因而在基因连锁诊断中应用日益广泛。

 

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