巨细胞病毒感染

【诊断】【治疗措施】【病原学】【发病机理】【流行病学】【临床表现】  

【概述】

CMV感染在全世界分布，人是CMV的唯一宿主。不同国家及不同经济状况感染率不同。chengrenCMV感染和免疫功能有密切关系。

【诊断】

单靠临床表现不能诊断CMV感染，从临床标本中分离出病毒，同时抗体呈出4倍以上增加或持续抗体滴度升高，将有助于诊断。

一、病毒分离

最好用唾液、尿液、生殖道分泌物、乳汁和白细胞，接种到人的成纤维细胞内繁殖和分离，细胞病变效应（CPE）在1天或数周后出现，经固定和HE染色后可观察到巨细胞，核内有内包涵体，核周晕圈及嗜酸性胞浆内包涵体，很象“猫头鹰眼”（owl′s eye）亦可用单克隆或多克隆抗体的荧光染色等方法检查。

二、血清抗体检测

最常用的有补体结合试验（CF）、间接免疫荧光试验（IIF）、免疫酶试验（EIA）、间接血凝试验（IHA）和放射免疫试验（RIA）等检测CMV-IgG和IgM抗体。当单份血清标本已确定既往有CMV感染时，应当立即留血清标本，以及间隔2周、4周、8周再留血清标本，结合病毒分离可作原发感染诊断。

三、DNA探针

已广泛应用于检测CMV，其中以32P标记的探针敏感性最高，对某些标本来说，杂交方法可能比病毒分离更敏感。

四、聚合酶链式反应（PCR）

（一）标本的采集及处理

采集的标本包括患者的血液、尿，以及腺体组织等。由全血制备的血沉棕黄层（buffy coats）可保存于-80℃；尿液标本可保存于液氮中。冻存标本应避免反复冻融。

尿液标本经2500r/min离心10min，以除去细胞碎片，收集上清液。由于尿液中含有PCR抑制剂，因此需用聚乙二醇（PEG6000）进行预处理：50μl尿上清与50μl 20%PEG6000和25μl 2mol/L NaCl混合，置冰浴中6h；15000r/min离心30min收集沉淀。再于6400r/min离心3min；尽可能吸去上清，将沉淀悬浮于蒸馏水中。该悬液可直接用于PCR扩增；扩增时应于100℃加热10min，迅速置冰浴中冷却。

（二）模板DNA的制备

1．由血液标本制备模板DNA

方法A：向血清中加入NaCl使最终浓度为150mmol/L；取10μl 此血清于70℃处理45s后即可直接进行PCR扩增。

方法B：由血沉棕黄层（BCP）制备：① 用PBS洗涤BCP两次，收取沉淀。② 加入500μl  6mol/L盐酸胍，匀浆。③ 加入30μl  10mmol/L EDTA，10mmol/L NaCl，30μl20% Sarcosyl和5μl 蛋白酶K（10mg/ml），混合均匀，60℃反应1h。④ 加入1130μl 的乙醇，-20℃沉淀1～2h。⑤ 离心收集DNA沉淀。⑥ 用70%乙醇洗两次，最后将沉淀悬浮于少量10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA中。置4℃备用。

2.由冰冻组织标本制备模板DNA：① 用恒冷切片机切取一块5～10μm冰冻组织块，置于1.5ml塑料管中。② 加入10%用缓冲液配制的福马林。③ 10min后离心1～2min轻轻倾去上清液，沉淀用乙醇洗2次。④ 于室温干燥10～60min。⑤ 加入抽提缓冲液（100mmol/L Tris-HCl，4mmol/L EDTA、pH8.0,400μg/ml蛋白酶K），使刚好浸没沉淀物（约50～100μl ）；将沉淀捣碎。福马林固定的或石蜡包埋组织经脱蜡和干燥后也可按此处理。⑥ 37℃放置过液。⑦ 置沸水中7min灭活蛋白酶K。⑧ 离心收集上清，取1～10μl 即可进行PCR扩增。

3.由尿液标本制备模板DNA：①100μl 尿上清液与100μl  6mol/L异硫氰酸胍，7μl  2mol/L NaCl和20μl 玻璃粉悬液（DNA PREP，Asahi Glass Co，Tokyo）混合。② 室温放置10min后，6400r/min离心2min，收集沉淀。③ 沉淀用50%乙醇，10mmo/L Tris-HCl、pH7.4, 50mmol/L NaCl洗一次，6400r/min离心1min。④ 同样洗涤沉淀2次，收集沉淀。⑤ 加入50μl 蒸馏水，于55℃作用15min。⑥ 15000r/min离心2min，收集上清（含HCMV DNA），进行PCR扩增，将此悬液于100℃加热10min，并迅速于冰浴中冷却。

（三）引物及探针

引物及探针的设计是根据已发表的CMV的直接早期蛋白基因的启动子区和开始的4个外显子序列、晚期抗原gp64基因以及磷酸化蛋白pp71基因序列。常用的引物和探针列在表3中。

（四）PCR扩增步骤

1．10×反应缓冲液：100mmol/L Tris-HCl、pH8.4，500mmol/L KCl，25mmol/L MgCl2，2mg/ml明胶。

Taq DNA 聚合酶：5U/μl 。

10×dNTP：4种dNTP各2.0mmol/L。

引物：100pmol/L。

2．常规PCR扩增

10×反应混合物（50μl）反应缓冲液 5μl

10×dNTP  5μl

模板DNA  5μl

Taq DNA聚合酶  0.2μl (IU)

引物 各0.5μl

蒸馏水 3.8μl

加1～2滴矿物油。

将反应混合物于94℃加热5min；然后于95℃ 30s，55℃ 40s，72℃ 60s，扩增35～40循环。

表3  CMV PCR扩增所用的引物及探针

引物及

探针

序列（5′→3′）

位置

片段

大小

IE1

CCACCCGTGGTGCCAGCTCC

早期基因

159（bp）

IE2

CCCGCTCCTCCTGAGCACCC

 

 

IE3（探针）

CTGGTGTCACCCCCAGAGTCCCCTGTACCCGCGACTATCC

 

 

LA1

CCGCAACCTGGTGCCCATGG

晚期gp64

139

LA2

CGTTTGGGTTGCGCAGCGGG

 

 

LA3（探针）

TTCTTCTGGGACGCCAACGACATCTACCGCATCTTCGCCG

 

 

IE1a

AGATCGCCTGGAGACGCCAT

早期外显子1

139

IE1b

GGAATCCGCGTTCCAATGCA