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巨细胞病毒感染(2)
来源：求医网 作者：求医网 点击:次 时间：2008-02-22
IE2a
ATGGAGTCCTCTGCCAAGAG
早期外显子2
72
IE2b
CCGTGGCACCTTGGAGGAAG
IE3a
GTGACCAAGGCCACGACGTT
早期外显子3
167
IE3b
TCTGCCAGGACATCTTTCTC
IE4a
ACAGATTAAGGTTCGAGTGC
早期外显子4
179
IE4b
CAATACACTTCATCTCCTCG
IE4c
TTACCAAGAACTCAGCCTTC
早期外显子4
158
IE4d
GTGCGTGAGCACCTTGTCTC
IE4e
TATACCCAGACGGAAGAGAAATTCA
早期外显子4
426
IE4f
ATAAGCCATAATCTCATCAGGGGAG
Pp1a
TAGCGCGCATACATCCCGAGTACAT
Pp71基因
316
Pp1b
ATGACGTTGCTCCGTGGAAAGAGACC
Pp71
3．套式（nested）PCR扩增：①反应混合物的组成同（2），仅引物为IE2a和IE4b（包括了整个外显子3，共721b），各100pmol。于94℃ 60s，52℃150s，72℃ 480s，扩增20循环。② 取2μl 上述扩增产物，各加100pmol的引物IE3a和IE3b补加其他试剂。然后，于94℃ 60s，52℃150s，72℃180s，扩增20循环。
（五）产物鉴定
扩增产物的分析可采用固相（滤膜）杂交和液相杂交试验。
1． 固相杂交：
① 预杂交液为3×SSPE，5×Denhardt，0.5%SDS和25%甲酰胺.含有扩增产物的滤膜于42℃预杂交30～60min。② 加入标记探针（10cpm/μg，2ng/ml），杂交30～60min。③ 用0.2×SSPE,.01%SDS分别于室温洗涤滤膜3次,5min/次;于60℃洗一次,10min/次;再于室温洗一次以上,5min/次。④ 自显影。
2． 液相杂交及电泳分析：
① 取1/10体积的扩增产物与0.5～1.0pmol末端记的探针混合。② 加入最终浓度为150mmol/L NaCl，10mmol/L磷酸钠及1mmol/L EDTA溶液，使总体积为20μl 。③ 95℃ 10min，然后于56℃ 60min。④ 离心10s加入样品缓冲液，于8%聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。⑤ 电泳毕，用溴化乙锭染色，然后对X线片曝光，自显影。
HCMV DNA分子很大，其碱基序列尚未全部搞清。虽然它的DNA的限制性内切酶片段长度具多形性，但是对其基因组的离散性还不清楚。用单一引物对进行PCR扩增，可鉴定90%的HCMV野型分离株；而采用针对不同HCMV序列的两套以上的引物对，则可检测几乎所有的病毒株。因此，可根据情况使用两对或两对以上的位于基因组不同区域的引物进行PCR检测。
在HCMV模板DNA制备过程中，有时会产生一些小片段DNA，在PCR反应时常导致一定水平的本底产物，从而影响对结果的判定。在这种情况下可采用套式PCR法，其基本原理就是靶DNA的扩增分为两步：首先利用一对引物，扩增包括靶DNA在内的长片段DNA；然后取少量的扩增产物，利用只针对靶DNA的引物再进行第二次扩增。通过控制每步中的扩增循环数，即可防止由小片段DNA引起的假阳性。这种方法也可避免产生假阴性结果。
PCR检测HCMV标本具有很高的敏感性。从HCMV感染的组织培养上清可检测到相当于几十个病毒的DNA分子或1～5PFU病毒的DNA序列。用非放射性寡核苷酸探针进行Southern杂交分析扩增产物，可从尿液标本中检测到1pgHCMV DNA序列的水平；利用该系统，在4×104个细胞中只有